Aldimin/ Ketoimin Nachweis

Wissenschaft Chemie
#1

Hallo,

ich versuche den enzymatischen Quervernetzungsgrad von Kollagen quantitativ nachzuweisen. Die Vernetzung geht immer über zwei Lysin- oder Hydroxylysin-Moleküle. Nachdem eins von beiden zum Aldehyd oxydiert wurde, kondensieren dieses mit der Aninogruppe des anderen Lysins zu einer Schiff’schen Base (-N=CH-), die ich gern quantitativ nachweisen würde.

Ich habe einen Hinweis gelesen, man könne diese Schiff’schen Basen ‚durch eine reduktion mit Borhydrid für Analysen stabilisieren‘ (-N-CH2-), allerdings  fehlt mir da immer noch die Idee zum quantitativen Nachweis.

Gruß, Jesse

#2

Hallo,

über zwei Lysin- oder Hydroxylysin-Moleküle. Nachdem eins von
beiden zum Aldehyd oxydiert wurde, kondensieren dieses mit der

zu welchem Aldehyd wir Lysin oder Hydroxylysin oxidiert?

Gruß

Tankred

#3

Hallo,

zu welchem Aldehyd wir Lysin oder Hydroxylysin oxidiert?

Lysin bzw. Hydroxylysin wird zu Allysin bzw. Hydroxyallysin oxidiert: http://de.wikipedia.org/wiki/Allysin

Weshalb ist der Name wichtig? Letztlich weist das Protein eine Seitenkette mit der Aldehydgruppe HC=O auf, welche mit der Aminogruppe NH2 eines anderen Lysinmoleküle unter Verlust eines Wassermoleküls zur Schiff’schen Base, den (Ald)imin reagiert. Korrekter Name des gebildeten Imins wäre dann Dehydrolysinonorleucin. Das will ich über die Imingruppe C=N quantitativ nachweisen, die sollte es nirgends sonst im Proteinmolekül geben.

Gruß, Jesse

#4

Moin,

Das will ich über die Imingruppe C=N
quantitativ nachweisen, die sollte es nirgends sonst im
Proteinmolekül geben.

kannst Du diese Gruppen mittel IR-Spektroskopie quantifizieren?
Als Film mittels ATR, oder Pressling.

Gandalf

#5

Hallo,

kannst Du diese Gruppen mittel IR-Spektroskopie
quantifizieren?
Als Film mittels ATR, oder Pressling.

mit IR wurde schon einmal von einem meiner Studenten versucht, den Vernetzungsgrad über die Anzahl der freien (unvernetzten) Aminogruppen zu bestimmen. Zur genauen Methodik kann ich nichts sagen, ich glaube er hat das Kollagen zwischen zwei KBr-Platten gepresst. Eine Reproduzierbarkeit der Messergebnisse war leider praktisch nicht gegeben, bei Mehrfachmessung derselben Probe kann praktisch jedes mal ein anderes Spektrum heraus. Das Problem war m. E., dass das Material nicht homogen ist, da es sich nicht um lösliches Kollagen sondern um Kollagenfasern aus aufgemahlener Schweinehaut handelt, also um eine Suspension von Partikeln jeder erdenklichen Form und Größe (bis 3 mm). Deshalb mache ich mir bzgl. IR keine großen Hoffnungen, probieren werden wir es aber auf jeden Fall.

Gruß, Jesse

#6

Moin,

Das Problem war m. E., dass das
Material nicht homogen ist, […] Größe (bis 3 mm).

ähm, wie willst Du generell mit so was etwas quantifizieren?!
Ich kann mir nicht vorstellen, daß Du in einem 3mm-Knubbel auch nur näherungsweise eine homogene Vernetzungsverteilung hinkriegst.

Wenn dann aber die Partikelgröße bei Deinen Untersuchungen klein genug ist, sollte ATR-IR kein Problem sein.
Mit einem IR-Mikroskop (in Kombination mit einem ATR) kannst Du auch punktuelle Verteilungen bzw. Vernetzungsgrade analysieren.

-C=N- sollte eine vernünftige IR-Absorbtion haben.

Gandalf

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#7

Hallo,

Lysin bzw. Hydroxylysin wird zu Allysin bzw. Hydroxyallysin
oxidiert: http://de.wikipedia.org/wiki/Allysin

zwei benachbarte Allysin- bzw. Hydroxyallysin-Reste können auch eine Aldolkondensation eingehen und eine dauerhafte Quervernetzung bilden. Es muß nicht unbedingt und ausschließlich eine Schiff’sche Base entstehen.

Unabhängig vom Chemismus einer eventuellen Reaktion würde ich zuerst bei verschiedenen Temperaturen - z.B. mit Hilfe der Viskosimetrie - versuchen, den erhofften Quervernetzungsgrad von Kollagen nachzuweisen.

Gruß

Tankred

#8

Hallo Gandalf,

Das Problem war m. E., dass das
Material nicht homogen ist, […] Größe (bis 3 mm).

ähm, wie willst Du generell mit so was etwas quantifizieren?!
Ich kann mir nicht vorstellen, daß Du in einem 3mm-Knubbel
auch nur näherungsweise eine homogene Vernetzungsverteilung
hinkriegst.

der Einwand wäre bei physikalischen Vernetzungsmethoden wahrscheinlich berechtigt. Bei dem versuchten quantitativen Aminogruppen-Nachweis mit TNBS (als Transmissionsmessung) wurde die Vernetzung allerdings chemisch in einer EDC/NHS-Lösung durchgeführt, da hätte ich mir trotz Fasermaterial eine recht homogene Vernetzung erwartet. Knubbel oder so bilden sich auch keine. Man kann sich das Material eher wie einen Zellstoffbrei vorstellen, der sich dünn ausstreichen und zu gleichmäßig glatten Plättchen (wie Papier) trocknen/ pressen lässt.

Wenn dann aber die Partikelgröße bei Deinen Untersuchungen
klein genug ist, sollte ATR-IR kein Problem sein.
Mit einem IR-Mikroskop (in Kombination mit einem ATR) kannst
Du auch punktuelle Verteilungen bzw. Vernetzungsgrade
analysieren.

Ist das Ziel der ATR-Methode, durch Ausnutzung wiederholter Reflexion Inhomogenitäten in Ausrichtung der Partikeloberflächen und Vernetzungsgrad herauszumitteln? Dann wäre das für unsere Zwecke perfekt, denn leider kann ich die Partikelgröße kaum reduzieren. Kollagen ist zäh, ein schlechter Wärmeleiter und denaturiert über Körpertemperatur - es ist ohne thermische Schädigung denkbar schwer zu mahlen.

Ich habe jetzt immerhin jemanden gefunden, der uns zwecks allgemeinem Funktionsnachweis mal zwei Proben mit ATR-IR vermessen würde. Nun müssen wir nur noch die Vernetzung hinbekommen, ich bin schon sehr gespannt. :smile:

Danke & Gruß, Jesse

#9

Hallo,

zwei benachbarte Allysin- bzw. Hydroxyallysin-Reste können
auch eine Aldolkondensation eingehen und eine dauerhafte
Quervernetzung bilden. Es muß nicht unbedingt und
ausschließlich eine Schiff’sche Base entstehen.

das wäre in der Tat für mein Projekt eine interessante Frage, da ich versuche mit UV-Licht die natürliche Quervernetzung im lebenden Tier unter Laborbedingungen an einem toten Material nachzustellen.

Bei der natürlichen Vernetzung werden nach meiner Erkenntnis IMMER die genannten Schiff’schen Basen gebildet, da es sich um eine enzymatisch katalysierte, sehr spezifische Reaktion handelt. Die UV-Vernetzung ist vermutlich sehr viel unspezifischer und wird eine ganze Menge von Reaktionen anstoßen. Ich will wissen, ob ein entscheidender Anteil der erzeugten Bindungen identisch zur natürlichen Quervernetzung im Tier ist, deshalb versuche ich diese Schiff’schen Basen gezielt quantitativ nachzuweisen.

Unabhängig vom Chemismus einer eventuellen Reaktion würde ich
zuerst bei verschiedenen Temperaturen - z.B. mit Hilfe der
Viskosimetrie - versuchen, den erhofften Quervernetzungsgrad
von Kollagen nachzuweisen.

Viskosimetrie hilft m. E. gar nicht weiter, da es sich um eine sehr heterogene Partikelsuspension und nicht um eine Lösung handelt. Bei neutralem pH-Wert würde ich nur die mechanischen Eigenschaften des Partikelsystems messen, im sauren pH-Bereich quillt die Kollagensuspension zu einem hochviskosen Hydrogel. Dessen Viskosität hängt offenbar von so ziemlich jedem Parameter in der langen mechanisch-chemisch-thermischen Aufbereitungskette von der Schweineschwarte zur Proteinsuspension mehr ab, als von der Quervernetzung der Fibrillen.

Viele Grüße, Jesse

#10

Moin,

da hätte ich mir trotz
Fasermaterial eine recht homogene Vernetzung erwartet.

wie vermeidest Du denn Gradientenbildung?
Vernetztes Material, so vermute ich mal, kann eine Diffusion recht effektiv unterbinden, oder wie hoch ist die Vernetzungsrate?

der sich dünn
ausstreichen und zu gleichmäßig glatten Plättchen (wie Papier)
trocknen/ pressen lässt.

das klingt schon mal gut :wink:

Ist das Ziel der ATR-Methode, durch Ausnutzung wiederholter
Reflexion Inhomogenitäten in Ausrichtung der
Partikeloberflächen und Vernetzungsgrad herauszumitteln?

Das kann ich Dir leider nicht sagen.

Kollagen ist zäh, ein
schlechter Wärmeleiter und denaturiert über Körpertemperatur -
es ist ohne thermische Schädigung denkbar schwer zu mahlen.

Solche ‚Kunden‘ sind m.E. ein Kandidat für eine Kryovermahlung. So hab ich selbst Proben von Polyethylen klein gekriegt.
So was z.B. http://www.retsch.de/de/produkte/zerkleinern/kugelmu…

Gandalf

#11

Hallo,

wie vermeidest Du denn Gradientenbildung?
Vernetztes Material, so vermute ich mal, kann eine Diffusion
recht effektiv unterbinden, oder wie hoch ist die
Vernetzungsrate?

bewusst vermeide ich Gradientenbindung nicht (noch nie dran gedacht). Das Material hat eine hohe Affinität zu meiner Vernetzerlösung auf Ethanol- und Wasserbasis und ich bin einfach mal davon ausgegangen, dass es relativ vollständig durchtränkt und ergo vernetzt wird. Es ist m. E., gemessen an der Gesamtzahl der Bindungen in der Proteinstruktur quantitativ auch relativ marginal, was durch Quervernetzung an zusätzlichen Bindungen eingetragen wird, es können ja nur ganz bestimmte Aminosäuren in ganz bestimmten Moleküldomänen überhaupt miteinander reagieren.
Reaktionskinetik habe ich keine, wir erreichen nach Standardvernetzungsdauer laut DSC-Messung aber einen Vernetzungsgrad von min. 95%, danach tut sich nicht mehr viel.

Solche ‚Kunden‘ sind m.E. ein Kandidat für eine
Kryovermahlung. So hab ich selbst Proben von Polyethylen klein
gekriegt.
So was z.B.
http://www.retsch.de/de/produkte/zerkleinern/kugelmu…

Naja, ist alles kompliziert, in genau dieser Schwingmühle war das Kollagen nach wenigen Minuten Mahldauer thermisch tot. Ähnlich schlechte Ergebnisse hatte ich auch beim Vermahlung mit einer C3 Spex (PC-Kapsel mit Magnetstößel im Stickstoffbad). Wir haben noch eine kleine Kryomühle ‚Bauart Moulinette‘, wo ich das Kollagen nass (~10% TS) und mit Stickstoff eingefroren mit einem Prallmesser vermahle - das geht noch am besten und reproduzierbarsten, könnte man mal zur Probenaufbereitung probieren.

Gruß, Jesse

#12

Moin,

Naja, ist alles kompliziert, in genau dieser Schwingmühle war das Kollagen nach wenigen Minuten Mahldauer thermisch tot.

manmanman, lass mir doch wenigstens eine winzige Chance :wink:

Tja, dann bin ich mit meinem Latein am Ende.

Gandalf

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#13

Hallo Jesse Bee,

Bei der natürlichen Vernetzung werden nach meiner Erkenntnis
IMMER die genannten Schiff’schen Basen gebildet, da es sich um

Das stimmt nicht ganz.
Man kann IMMER noch etwas dazulernen siehe z.B. unter „Quervernetzung“ bei:
http://de.wikipedia.org/wiki/Kollagen
darin u.a.:
„Die beiden benachbarten Allysinreste gehen eine Aldolkondensation ein, womit diese Nachbarschaft durch eine dauerhafte Quervernetzung fixiert ist.“
Die obigen Ausführungen bei Wiki beziehen sich auch auf „natürliche Vernetzung“ wie von dir: „Bei der natürlichen Vernetzung …“ gefordert.

Vielleicht kaufst du einmal ein Kollagen von Fa. Sigma-Aldrich. Eventuell sind die Produkte einheitlicher in der Konsistenz und kein solcher Schlunz mit dem du dich leider herumschlagen mußt.
Z.B ist Kollagen aus der Haut des Kalbes, Produkt C3511-10 MG (bei genannter Firma sind noch Restmengen verfügbar), in wässeriger Säure löslich.
Die Type C9791 – ebenfalls aus der Haut des Kalbes – soll in 0,1 M Essigsäure nach längerem Rühren bei Raumtemperatur löslich sein.
Die Firma gibt auch Literaturstellen an, nach deren Arbeitsweise sie die Produkte hergestellt haben.
Für „C9791“ z.B.:
„Preparation Note
This product was prepared by a modification of Gallop, P.M. and Seifter, S., Meth. Enzymol., VI, 635 (1963).“

Viel Erfolg, daß du die Vernetzung hinbekommst. Ich bin auch schon sehr gespannt. :smile:“

Tankred.