Enzymkinetik: Blockversuche

Wissenschaft Naturwissenschaften allgemein
#1

In einem Enzymassay, habe ich verschiedene Block-Konzentrationen einer Substanz mit meinem Zielenzym inkubiert, um die besten Inhibitorkonzentration des Blockers heraus zu finden, doch ich erhalte verwunderliche Ergebnisse:

  • sehr niedrige Konzentrationen blocken nur schwach (die Block-Konzentration ist hier wahrscheinlich zu gering)
  • mittlere Konzentrationen blocken gut
  • aber bei sehr hohen Block-Konzentrationen erhalte ich noch höhere Werte als bei der nicht geblockten Reaktion --> das ist ein Phänomen, dass ich mir nicht erklären kann und eine Erklärung dafür brauche. Warum bewirkt eine hohe Block-Konzentration eine Aktivitätssteigerung meines Enzyms?

Gibt es da draußen jemanden der sich super mit Enzymkinetik auskennt und mir da helfen kann?

Vielen Dank und liebe Grüße

#2
  • aber bei sehr hohen Block-Konzentrationen erhalte ich noch
    höhere Werte als bei der nicht geblockten Reaktion --> das ist
    ein Phänomen, dass ich mir nicht erklären kann und eine
    Erklärung dafür brauche. Warum bewirkt eine hohe
    Block-Konzentration eine Aktivitätssteigerung meines Enzyms?

Ich habe darüber nachgedacht, aber kein plausibles Modell dafür gefunden. Andere wohl auch nicht, sonst hättest Du schon eine Antwort bekommen. Es gibt allosterische Effektoren die an einer vom aktiven Zentrum entfernten Stelle andocken und das aktive Zentrum für Substrate besser zugänglich machen. Aber: bei niedriger Konzentration inhibieren und bei höherer Konzentration aktivieren habe ich noch nicht gehört.
Das Ionen/pH Milieu bleibt konstant, egal welche Inhibitor- Konzentration ???
Udo Becker

#3

Hallo,

eine Idee hätte ich:

Wenn das Blockingreagens eine „Verunreinigung“ mit einem Kofaktor enthält, der im Assay im Mangel ist und Blockingreaktion behindert, würde man erwarten können, dass die Enzymaktivität steigt, wenn man hohe Konzentrationen an Blockingreagens im Ansatz hat.

Ich könnte mir zB. vorstellen, dass zB. Magnesium-Ionen oder irgendwelche Salzionen drin sind, welche die Konformation des Enzyms ändern, so dass das Blocking nicht mehr (gut) funktioniert aber das (ungeblockte) Enzym aktiv bleibt. Oder das Enzym schafft unter diesen Bedingungen nach einem anderen Mechanismus katalysieren, der nicht geblockt wird (halte ich für unwahscheinlich, ist aber nicht ganz unmöglich).

Nur so 'ne theoretische Idee. Ich kenne kein reales Beispiel dafür. Wahrscheinlich ist die Idee falsch, aber vielleicht führt sie ja jemanden zur richtigen Lösung.

VG
Jochen

#4

Hallo Bianca,

Warum bewirkt eine hohe
Block-Konzentration eine Aktivitätssteigerung meines Enzyms?

ich weiß es nicht, habe aber einen Denkansatz: Von der Substratüberschusshemmung kennt man ja, dass bei steigender Substratkonzentration irgendwann die Reaktionsgeschwindigkeit abnimmt, weil die Substratmoleküle um das aktive Zentrum konkurrieren und dieses quasi blockieren. Ich könnte mir vorstellen, dass es so etwas auch bei allosterischen/nichtkompetitiven Inhibitoren gibt, so dass die sterische Wechselwirkung am allosterischen Zentrum nicht zu einer hemmenden Konformationsänderung am aktiven Zentrum führt.

Hast du mal eine Kinetik (Lineweaver-Burk) ohne Inhibitor und mit vergleichsweise niedrigen Inhibitorkonzentration im Bereich, wo es noch deinen Erwartungen entspricht, gemacht? Da lässt sich herausfinden, ob der von dir untersuchte Inhibitor ein allosterischer/nichtkompetitiver Inhibitor ist (was ich vermute) oder nicht.

LG
Huttatta

#5

P.S.
Ich habe dein Posting leider etwas zu schnell gelesen: Höher als bei der ungeblockten Reaktion? Das sieht mehr nach einem Fehler aus. Hast du den Versuch wiederholt?