Hallo ihr lieben, ich würde hier gerne ein Bild hochladen, weiss einer wie das geht`?
Ich mache grade eine PCR und habe folgendes Problem. Die ganze Zeit ging es super, auf einmal hatte ich eine Kontamination im Blank… daraufhin habe ich alle Substanzen ausgetauscht und neue genommen, aber die Kontamination blieb. Ich habe alles sauber gemacht, aber trotzdem… jetzt hatte ich die Vermutung, dass die Kontamination ev im thermocycler sitzt, da sie mit jedem Lauf mehr wird… also die Bande auf dem Gel wird immer dicker… Ich habe den Cycler sauber gemacht, aber immernoch… das komische daran ist, ich habe eine Bande in meiner Kontrolle, die nicht so groß ist wie mein eigentliches Produkt, sondern viel kleiner…daher habe ich vermutet, dass dir primer irgendwas machen was sie nicht sollen… allerdings haben sie vorher einwandfrei funktioniert… ausserdem habe ich in den Proben diese Bande nicht, sondern einfach nur unheimlich viel Produkt… gibt es irgendwas, was in meine Proben geraten sein könnte, was im Blank, also ohne template, eine Bande für ziemlich kurze (ca 70bp, ca primergröße…) verursacht, was aber in Verbindung mit Template diese Bande nicht bringt sondern nur die des eigentlichen produktes verstärkt?? bitte, es wäre super wenn einer ne Idee hat…ich bin langsam mit meinem Latein am ende und ich komme sonst nicht weiter…
Hallo,
was ist dein „Blank“: Wasserkontrolle, Minus-RT-Kontrolle oder was anderes?
Bei den unerwünschten Banden relativ kurzer Produkte handelt es sich wahrscheinlich um sog. Primer-Dimere.
Komisch ist allerdings, dass dieses Nebenprodukt wohl plötzlich auftrat. I.A. hat man das entweder immer oder nie. Die Bildung von Primer-Dimeren hat allerdings auch einen stochastischen Aspekt, so dass es durchaus lange keine gibt, dann plötzlich gibt es sie einmal (in einer PCR) und wenn man sie dann als Kontamination verschleppt, hat man sie immer wieder.
Wenn Du Kontaminationen hast, dann wäre aber auch wahrscheinlich, dass ein Wunschprodukt kontaminiert. Das scheint aber nicht der Fall zu sein. Also: Die Sache bleibt komisch.
Vorhandene Kontaminationen sine extrem schwer wieder loszuwerden. Mit dem Öffnen eines PCR-Eppis nach der PCR gehen Billiarden Moleküle als Aerosol aus Wanderschaft, und als Kontamination reicht oft schon ein einziges Molekülchen, was den Weg in eine frisch angesetzte PCR findet.
Um Kontaminationen wirkungsvoll auszuschließen, solltest du unbedingt ALLES neu bestellen und die PCR KOMPLETT mal in einem GANZ ANDEREN LABOR machen (am besten in einem anderen Stockwerk oder anderen Gebäude). Wenn Du vorher in deinem Labor warst, Kittel ausziehen,
Hände gut waschen, und NICHTS! aus deinem Labor mitnehmen. Aus eigener leidvoller Erfahrung weiss ich, dass alles andere dich letztlich nicht
weiterbringt.
Doch noch was Gutes:
Wenn in den „Blanks“ irgendwelche Banden auftreten, die klar nicht die des Wunschproduktes sind, dann gilt das als negative Kontrolle (also alles in Butter - so soll es sein). Ich kenne Deine Fragestellung nicht, aber für eine normale PCR zum Nachweis einer Zielsequenz reicht das absolut aus, sofern du gezeigt hast, dass du ein akzeptables „limit of detection“ erreichst. Ich würde mir hier keinen Kopf machen. Problematisch wird das erst bei quantitativen Assays (zB. bei real-time-PCR), wenn durch die Bildung unspez. Produkte die Amplifikationseffizienz des Zielprodukts beeinflusst wird und man so systematische Fehler bekommt.
Und ein Tipp gegen Kontaminationen:
Nimm einen PCR-Mix mit UNG (Uracil-N-Glycosylase) und dUTP statt dTTP. Das ist ein sehr effektiver Schutz vor Kontaminationen. Allerdings kannst du damit keine PCR-Produkte zur Klonierung usw. erzeugen, sondern nur für die unmittelbare Analyse (Gel od. Schmelzkurve).
VG
Jochen
Hi jochen, erstmal vielen Dank für die schnelle Antwort:
Also: Mein Blank ist ne Wasserprobe… also mastermix wie auch für die proben, nur statt template halt wasser…
an Primerdimere hatte ich auch gedacht, da die aber vorher nie da waren hab ich das wieder verworfen…
„Die Bildung von Primer-Dimeren hat allerdings auch einen stochastischen Aspekt, so dass es durchaus lange keine gibt, dann plötzlich gibt es sie einmal (in einer PCR) und wenn man sie dann als Kontamination verschleppt, hat man sie immer wieder“
–> was genau meinst du mit stochastischem Aspekt??
Ich mache meine PCR mit cDNA und bei der Herstellung hab ich auch alles überprüft und da war alles ok…deswegen kanns irgendwie nicht aus dem template kommen…
Das Problem ist, dass ich nicht nur nachweisen will, sondern auch quantifiezieren… und ich merke halt, dass seit der komischen Bande auch meine Produkte total überladen sind… also hat das schon irgendwie einfluss… ich würd hier ja gerne mal ein bild reinstellen…weisst du wie das geht`??
Ich werd nochmal neue Primer bestellen und das versuchen und ansonsten frag ich mal rum, ob ich das in nem anderen Labor machen kann… das komische ist halt ,dass das protokoll udn die primer so schon die ganze zeit verwendet wurden und auf einmal taucht da diese komische bande auf…
achso und nochwas :
„Nimm einen PCR-Mix mit UNG (Uracil-N-Glycosylase) und dUTP statt dTTP. Das ist ein sehr effektiver Schutz vor Kontaminationen. Allerdings kannst du damit keine PCR-Produkte zur Klonierung usw. erzeugen, sondern nur für die unmittelbare Analyse (Gel od. Schmelzkurve).“
Das hab ich noch nie gehört… was genau bringt das? kann ich das auch bei cDNA benutzen und kann ich das Produkt dann später mit nem restriktionsenzym schneiden??
Hi,
–> was genau meinst du mit stochastischem Aspekt??
Naja, es *können* in einer PCR solche Nebenprodukte entstehen, es *müssen* aber keine entstehen. Und *wenn* welche entstehen, dann kann das nach dem esten, zweite oder jedem andene Zyklus sein (ab dann werden sie als Templates aber exponentiell amplifiziert). Auch *können* verschiedene Produkte entstehen, jenachdem, welchen Blödsin Primer und Polymerase in dem betreffenden Ansatz gerade machen.
Ich mache meine PCR mit cDNA und bei der Herstellung hab ich
auch alles überprüft und da war alles ok…deswegen kanns
irgendwie nicht aus dem template kommen…
? Was hast du bei der RT überprüft, was die Aufschluss über Kontaminationen oder „schlechte Primer“ geben könnte?
Das Problem ist, dass ich nicht nur nachweisen will, sondern
auch quantifiezieren… und ich merke halt, dass seit der
komischen Bande auch meine Produkte total überladen sind…
Naja, auch das ist eigentlich egal. Eher sogar gut, weil Du so weniger Material brauchst, bzw. schon bei weniger Ausgangsmenge schon eine Bande siehst. Du musst sicherstellen, dass du den interessanten Mengenbereich auch quantifizieren kannst. Dazu musst du Verdünnungsserien ansetzen und zeigen, dass (in diesem Bereich) die Bandendichte (oder was immer du misst) proportional ist zur eingesetzten Menge. Bei Nebenprodukte, die in blanks auftreten, kann das einen Einfluß auf die LOD (limit of detection) und die LOQ (limit of quantification) haben. Wenn die LOQ klar kleiner ist, als das, was du quantifizieren willst, ist alles gut.
also hat das schon irgendwie einfluss… ich würd hier ja gerne
mal ein bild reinstellen…weisst du wie das geht`??
Geht hier nicht. Da musst du einen beliebeigen anderen Dienst nehmen und hier einen Link reinsetzen.
Ich werd nochmal neue Primer bestellen und das versuchen und
ansonsten frag ich mal rum, ob ich das in nem anderen Labor
machen kann… das komische ist halt ,dass das protokoll udn
die primer so schon die ganze zeit verwendet wurden und auf
einmal taucht da diese komische bande auf…
Willkommen im Leben 
VG
Jochen
Das hab ich noch nie gehört… was genau bringt das? kann ich
das auch bei cDNA benutzen und kann ich das Produkt dann
später mit nem restriktionsenzym schneiden??
http://www.nature.com/leu/journal/v15/n12/full/24022…
(hättest du auch finden können… 
)
Zum Restriktionsenym:
Es wird wie gehabt dsDNA gebildet. Nur mit U statt T. Wenn das Restiktionsenzym U und T nicht unterscheidet, ist es kein Problem. Wenn doch, aber die Erkennungssequenz kein T enthält, ist es auch kein Problem.
VG
Jochen
Also mittlerweile haben wir alles etwas eingegrenzt…meine Kollegin hat das gleiche Problem wie ich. Wir bekommen beide eine Bande von ca 70 bp. Ich bekomme sie allerdings nur im blank, sie bekommt sie überall. Sie benutzt aber auch viel weniger template als ich weil sie einzelzellen macht…
hier das Gelbild von mir:
http://img693.imageshack.us/i/04062010500ms.jpg/
ganz links: ladder, danach blank mit altem Wasser, daneben blank mit neuem Wasser und dann jeweils zwei Proben mit template für altes und zwei für neues wasser…
Meine vermutung ist nun: die primer machen irgendwas was sie nicht sollen, und sobald genug template da ist, machen sie es nicht mehr… meine kollegin und benutzen verschiedene Kits, dh das einzige was wir gemeinsam nutzen sind die primer und die pcr maschine und die pipetten. Ich denke nicht dass es eine Kontamination ist, die in den pipetten oder so sitzt, sonst wäre die Bande weiter oben auf Produktgröße… das merkwürdige ist, dass das protokoll mit den primern vorher geklappt hat und auf einmal nicht mehr… wir haben sowohl einen alten stock als auch einen neuen ausprobiert aber kein unterschied… was kann das bloss sein?? die bande ist ca 70 bp lang, ca so lang wie beide primer zusammen… kann es sein dass die sich auf einmal nebeneinander anlagern?? warum dann so plötzlich und warum nicht wenn viel template da ist??? ich werd noch bekloppt, ich komm überhaupt nicht voran weil wir nicht mehr weiter wissen…
Es wäre toll wenn sich ein pcr experte melden würde ))
Was du schreibst, ist typisch für eine Bildung von Primer-Dimeren.
Meine vermutung ist nun: die primer machen irgendwas was sie
nicht sollen, und sobald genug template da ist, machen sie es
nicht mehr…
Das ist normal. Es gibt eine kompetitive Verdängung bei der parallelen Amplifikation zweier Produkte. Entweder, es „gewinnt“ das Produkt, was von Anfang an im Überschuß war, oder da, was die bessere Amplifikationseffizienz hat. Daher ist das mit der quantitativen kompetitiven PCR auch so ein Problem (-> interne Standards müssen die selben Primerbindestellen haben und die selbe Länge und möglichst ähnliche Sequenz; und auch dann ist die Quantifizierung nur genau am Äquivalenzpunkt).
meine kollegin und benutzen verschiedene Kits,
dh das einzige was wir gemeinsam nutzen sind die primer und
die pcr maschine und die pipetten.
Wenn schon trenne, dann richtig. Sonst habt ihr keine Chance, die Kontaminationsquelle zu isolieren/finden.
Ich denke nicht dass es
eine Kontamination ist, die in den pipetten oder so sitzt,
sonst wäre die Bande weiter oben auf Produktgröße…
Ja, kann sein: Es gibt eine Kontamination mit einer DNA, die im Zusammenspiel mit euren Primern das ungewünschte Produkt liefert. WENN ihr diese mögliche Kontamination wegbekommt bzw. die PCRs mal mit gänzlich neuen Reagenzien in gänzlich neuen Räumen (wo möglichst noch nicht mit PCRs oder Plasmiden gearbeitet wurde) und Pipetten ansetzt, sollten dann die 70bp-Banden wieder weg sein.
das
merkwürdige ist, dass das protokoll mit den primern vorher
geklappt hat und auf einmal nicht mehr…
Und an den Bedingungen wurde nichts geändert (auch: IDENTISCHE Chargen aller Reagenzien? SELBES PCR-Gerät etc.?) Dann kann es, wie oben beschrieben, eine Kontamination mit einer DNA (Plasmid, anderes PCR-Produkt, alte Primer-Dimere! o.ä.) sein.
Ich halte das aber für unwahrscheinlich.
bp lang, ca so lang wie beide primer zusammen… kann es sein
dass die sich auf einmal nebeneinander anlagern??
Die Bildung unspezifischer Produkte alleine aus den Primern ist eine komplexe Sache. Genau geklärt ist ihre Entstehung nicht. Es gibt einige alte Publikationen dazu, sicher findest du da in PubMed einiges, aber nichts, was dir weiterhilft.
warum dann
so plötzlich und warum nicht wenn viel template da ist???
Das habe ich oben erklärt.
ich
werd noch bekloppt, ich komm überhaupt nicht voran weil wir
nicht mehr weiter wissen…
Wie gesagt: solange die Bande bei Template-Konz. auftritt, die unterhalb der zu quantifizierenden Konz. lieg, ist es KEIN Problem. Bei single-cell-Ansätzen ist das natürlich problematisch. Hier ist auch unbedingt eine Minus-RT-Kontrolle zu machen!
Es wäre toll wenn sich ein pcr experte melden würde
Hey, ich bin PCR-Experte! Menno!
VG
Jochen
Ja, kann sein: Es gibt eine Kontamination mit einer DNA, die
im Zusammenspiel mit euren Primern das ungewünschte Produkt
liefert. WENN ihr diese mögliche Kontamination wegbekommt bzw.
die PCRs mal mit gänzlich neuen Reagenzien in gänzlich neuen
Räumen (wo möglichst noch nicht mit PCRs oder Plasmiden
gearbeitet wurde) und Pipetten ansetzt, sollten dann die
70bp-Banden wieder weg sein.
ja das werden wir nochmal versuchen, haben jetzt neue primer bestellt, und werden die pipetten und die maschine nochmal säubern… was anderes fällt mir auch nicht mehr ein
Und an den Bedingungen wurde nichts geändert (auch: IDENTISCHE
Chargen aller Reagenzien? SELBES PCR-Gerät etc.?) Dann kann
es, wie oben beschrieben, eine Kontamination mit einer DNA
(Plasmid, anderes PCR-Produkt, alte Primer-Dimere! o.ä.) sein.
an den bedingungen wurde sonst nichts geändert, nein… dieselben chargen, selbers pcr gerät…
allerdings nutzen das auch noch andere aus dem labor, vielleicht ist wirklich was in die maschine gespritzt oder so…aber wie kommt es dann in unsere verschlossenen eppis???
Es wäre toll wenn sich ein pcr experte melden würde
Hey, ich bin PCR-Experte! Menno!
Oh ja ich wollte, noch einer schreiben! nicht falsch verstehen bitte, ich bin dir schon sehr dankbar
Hallo,
wie Jo schon meinte, hast du oder besser gesagt habt du und deine Kollegin eine Kontamination in eurer Reaktion. Woher die kommt, kann man hinterher nicht mehr genau sagen. Die Tips die du bekommen hast, sollten im Regelfall ausreichen, um die Ursache zu eliminieren.
Dass heißt, benutze für deine Reaktion völlig neue Lösungen und Materialien. Damit meine ich, nicht nur einfach von einem Stock etwas neues abfüllen, sondern alle benötigen Lösungen komplett neu bestellen (Puffer für RT und PCR, dNTPs, Primer, RT-Enzym, Taq…).
Des Weiteren sind Pipetten die häufigste Ursache für Kontaminationen, gerade, wenn sie von mehreren benutzt werden. Also reinige deine Pipetten. Oder, wenn möglich, benutze ander Pipetten, die noch nie mit irgenwelchen Templates in Berührung gekommen sind, die durch die Primer amplifiziert werden (am Besten Pipetten, die nur in anderen Räumen benutzt werden).
Wenn du PCR-Cups und Spitzen benutzt, die bei euch im Autoklaven sterilisiert werden, dann probiere einmal eine Reaktion mit Cups und Spitzen direkt aus der Tüte, die vorher natürlich noch nicht geöffnet wurde. Autoklaven können Konatminationen verschleppen.
Auch kann die Umgebung kontaminierende Substanzen enthalten, also geh in ein Labor, in dem mit keinen durch die verwendeten Primer amplifizierbaren Konstrukte gearbeitet werden. Wenn es keins gibt, geh in dein Büro, auf den Flur oder so. Nimm auch deinen Kittel nicht mit, der könnte auch die Ursache der Kontamination sein.
Wenn du Wasser benutzt, dass ihr selbst durch eine Filteranlage/Destille herstellt, kann es auch die Ursache der Kontamination sein. Probier einfach mal Leitungswasser aus irgendeinen anderen Labor (Toillette). Für ne einfache PCR erstmal ausreichend, solange du natürlich nicht irgendwelche verbreitete bakterielle DNA untersuchst.
Also, zusammenfassend:
- Bestelle alle Lösungen neu
- Geh mit den neuen Lösungen (nicht in deinen Labor öffnen), Tüten
mit PCR-Cups und Spitzen usw.(unautoklaviert, direkt aus neuer
Tüte) in einen neuen Raum - Stelle deine Arbeitslösungen dort mit den anderen Pipetten
her/deinen gereinigten Pipetten - Setze deine PCR an
- Halte die Cups geschlossen und überprüfe, dass sie richtig
schließen, bevor du sie in den Thermocycler stellst
Wenn das trotzdem zu einer Kontamination führt, dann designe neue Primer, die an anderen Stellen des Templates binden. Um Primer-Dimere und Strukturen zu verhindern, benutze ruhig dazu eine Software, die dir sowas anzeigt. Wenn die neuen Primer zu dem gleichen Ergebnis führen, versucht man dann die Effizienz zu erniedrigen und die Spezifität zu erhöhen. Dass heißt, die Konatmination wird zwar auch amplifiziert, aber man sieht es nicht, da das Produkt zu gering ist. So lange du dich mit deiner Reaktion im exponentiellen Bereich bewegst, ist das ok. Dazu würde man, das PCR-Programm verändern. Also, weniger Zyklen für eine geringere Ausbeute und höhere Annealingtemperatur für eine höhere Spezifität.
Gruß
nok
Ich kann mich dem was Nok sagt nur anschließen. Alles was
nicht steril sein muss, sondern nur zur PCR Amplifikation dient besser nicht
autoklavieren, sondern aus einer sauberen Packung entnehmen. Dort wo du deine
PCRs durchführst niemals Plasmid DNA oder PCR Amplifikate pipettieren.
Dekontamination mit kurzwelligem UV Licht ist im Gegensatz zum Autoklavieren gut
geeignet um DNA Kontaminationen zu entfernen. DNA die ausreichend lange UV
bestrahlt wurde kann in der PCR nicht mehr amplifiziert. Ein PCR Kabinett
oder PCR Workstation mit eingebauter UV Leuchte ist hier sehr hilfreich. Damit
kannst du auch deine Pipetten und Gebrauchsmaterialien dekontaminieren. Die
gemeinsame Verwendung des Thermocyclers stellt kein Kontaminationsrisiko dar,
da deine Tubes ja verschlossen sind, die Primer könnten allerdings sehr wohl
kontaminiert sein. Also neue bestellen.
VG
Kaja