Hallo miteinander,
ich hatte gestern im Labor ein Problem, das ich mir nicht erklären kann:
Ich habe einen Mastermix für eine reverse Transkription pipettiert, bestehend aus Puffer, Primer und reverser Transkriptase. Hatte zwölf Proben und deshalb für 13 Proben den MM angesetzt. Eigentlich keine komplizierte Sache. Als ich den Fertigen Mastermix dann aber zu meiner Template-RNA pipettieren wollte, war nach 3 Eppis der Mastermix leer. Ich habe ganz sicher die Pipetten richtig eingestellt und kann nicht verstehen, was da schief gelaufen ist.
Nun meine Überlegung: In unserem RNA-Labor hat es derzeit um die 32°C. Kann es sein, dass sich die Lösungen beim Pipettieren einfach verflüchtigt haben? Obwohl ich auf Eis pipettiert habe?
Weiß wirklich nicht wo mein Fehler lag. Bin irgendwie ziemlich verunsichert und die Materialien für den Mastermix sind ja auch nicht ganz billig…
Hallo,
es kann verschiedene Gründe geben, verflüchtigt sollte sich hier nicht viel haben, und schon gar nicht 70-80% der Lösung.
Hast du sicherlich richtig pipettiert, nicht die Pipette ganz durchgedrückt. Hast du die verwendeten Pipetten erneut nachgeprüft (Becherglas auf Präzisionswaage und mit Wasser nachprüfen, könnte ja eine Pipette kaputt sein). Hast du die richtigen Spitzen verwendet. Hast du einen Bestandteil z.B. Wasser vergessen. Hast du dich verrechnet (am Taschenrechner ist eine 10er Potenz schnell verloren).
Wie war die Lösung danach, den Mastermixansatz hast du sicherlich in einem 1ml Eppi gemacht, also war es bei einem Ansatz von ca. 20mikroliter ca. 300 mikroliter also 1/3 voll. Sollte dies dann auf 60 mikroliter geschrumpft sein, so kannst du kaum noch etwas im eppi sehen.
Hoffe es hilft,
LG
BadReality
Hi,
ich hatte gestern im Labor ein Problem, das ich mir nicht
erklären kann:
Hinterher ist es immer so, dass man meist keine Erklärung dafür findet.
Ich habe einen Mastermix für eine reverse Transkription
pipettiert, bestehend aus Puffer, Primer und reverser
Transkriptase.
Kann es sein, dass du Wasser (ddH2O, MiliqH2O, DEPC-H2O) zum Auffüllen auf das benötigte Volumen vergessen hast?
Hatte zwölf Proben und deshalb für 13 Proben
den MM angesetzt.
Sollte reichen, ja. Dabei ist zu beachten, dass ab 20 Proben 2 Extraansätze, ab 30 Proben 3 Extraansätze usw. sinnvoll sind, da du ja einen prozentualen Fehler beim Pipettieren hast.
Als ich den Fertigen Mastermix dann aber zu meiner Template-RNA
pipettieren wollte, war nach 3 Eppis der Mastermix leer.
Das ist schon sehr wenig. Das heißt ja, du hast ledig 1/4 von dem gedachten MM gehabt. Da vermute ich wirklich, dass du vergessen hast, Wasser in den MM zu geben.
Ich habe ganz sicher die Pipetten richtig eingestellt und kann
nicht verstehen, was da schief gelaufen ist.
Kann man hinterher nicht mehr mit Bestimmtheit sagen. Du kannst dir nicht vorstellen, wieviele Diplomanden mir immer wieder beteuert haben, dass sie alles nach Protokoll gemacht haben und die Pipetten richtig eingestellt haben. Es kann immer mal passieren, dass man in Hektik ist und nicht richtig aufpasst. Schließe auch bei mir nie aus, dass es an mir lag.
Nun meine Überlegung: In unserem RNA-Labor hat es derzeit um
die 32°C. Kann es sein, dass sich die Lösungen beim
Pipettieren einfach verflüchtigt haben? Obwohl ich auf Eis
pipettiert habe?
Eher nicht. Die Primer liegen meist in Wasser vor sowie der Puffer auch. Da musst du schon mehr als 32°C im Labor haben damit 3/4 deines MM verschwindet. Außerdem, schreibst du ja, dass deine Komponenten und der Mix auf Eis lag. Also, wirklich nicht möglich, selbst, wenn du die Sachen bei RT hingestellt hättest.
Weiß wirklich nicht wo mein Fehler lag.
Mögliche Fehler sind:
A) Pipetten
- Pipetten falsch eingestellt
- falsche Pipette benutzt und dort das „richtige Volumen“ eingestellt
(z.B. eine 20er statt 200er oder 100er genommen, so dass du z.B. nach deiner Meinung
50µl eingestellt hast, aber im Endeffekt nur 5µl hattest) - Pipettenspitzen saßen nicht richtig, so dass nicht das vollständige Volumen angezogen
wurde
(Immer, wirklich immer per Auge kontrollieren, dass das in der Spitze befindliche
Volumen dem gewünschten entspricht. So ein Blick ist durch Übung und pipettieren an der
Waage schnell erreichbar.) - Pipetten pipettieren fehlerhaft (Kontrolle per Waage)
B) Wasser vergessen hinzuzugeben - Wasser vergessen zum MM hinzuzugeben
(Falls in deinem Protokoll, das Wasser zum MM gegeben wird, sollte bei dir der Fall gewesen sein) - Template vergessen zu verdünnen
(Falls in deinem Protokoll, der Puffer durch das Template verdünnt wird.)
Bin irgendwie ziemlich verunsichert und die Materialien für den Mastermix sind ja
auch nicht ganz billig…
Fehler passieren, da bist du nicht der Erste. Lass dich davon nicht runterkriegen oder verunsichern. Fange einfach noch einmal von vorne an und nimm dir viel Zeit und kontrollier jeden Schritt.
Also, lese noch einmal das Protokoll, berechne den Mastermix neu, kontrollier deine Pipetten an der Waage (pipettieren sie noch im akzeptablen Rahmen) und überprüfe jeden Pipettierschritt mit dem Auge. Dann sollte alles eigentlich funktionieren.
Gruß
nok
Also am Wasser kanns nicht gelegen haben.
In den Mastermix kommt nämlich gar keins rein.
Der Ansatz je Probe hat ein Gesamtvolumen von 20 µl.
13 µl davon sind der Mastermix, bestehend aus 10 µl Puffer, 1 µl Primer und 2 µl Transkriptase. Die anderen 7 µl sind meine Template-RNA plus Wasser. Ich soll laut
Protokoll 500ng RNA einsetzen und da ich in jeder Probe eine andere Konzentration habe,
muss ich für jede Probe separat berechnen wie viel von den 7 µl Wasser und wie viel Template sind.
Wenn ein Verflüchtigen der Materialien eher unwahrscheinlich ist, dann wird sich wohl im Nachhinein auch nicht mehr feststellen lassen, worans gelegen hat. Ich hab bei so kleinen Volumina auch immer ein Auge drauf, ob beim pipettieren tatsächlich was in die Spitzen gesaugt wird und man hat ja auch grob ein Gefühl für das Volumen.
Alles ziemlich merkwürdig. Da bleibt mir wohl nichts übrig, als es einfach nochmal zu versuchen.
Bin jetzt gerade bei meiner Masterarbeit und sowas ist mir in 10 Semestern Studium noch nie passiert…
Hilft aber alles nix. Jedenfalls vielen Dank für die Antwort! Tröstet mich schon ein bisschen.
Hi,
Also am Wasser kanns nicht gelegen haben.
In den Mastermix kommt nämlich gar keins rein.
O.k. Dann wird der Puffer durch das Template verdünnt. Ist eher eine umständliche Methode. Gerade wenn du so etwas öfter machts (bei mir ca. 100 - 300 Proben pro Tag) ist das sehr zeitaufwendig. Da ist es ratsam jede RNA auf eine bestimmte Konzentration verdünnt zu verwenden (nicht die komplette RNA verdünnen, da stabilder, wenn hochkonzentriert). Bei dir z.B. dass du von deiner RNA jeweils eine Verdünnung mit der Konzentration 500ng/µl erstellst und diese für die Reverse Transkription verwendest. Dann brauchst du nur in jedes PCR-Cup 1µl Proben-RNA geben + 19µl MM. Spart viel Zeit und minimiert Pipettierfehler.
Der Ansatz je Probe hat ein Gesamtvolumen von 20 µl.
Sehr hoher Ansatz. Verstehe daher deine Bedenken hinsichtlich der Kosten. Benötigst du soviel für die weiteren Untersuchungen? Bei uns, auch die Anfänger, werden im Regelfall 5µl Ansätze gefahren. Im Einzelfall, wenn das Enzym zu Neige geht, mache ich auch mal nur einen 2µl Ansatz (brauche für die nachfolgende PCR auch immer nur 1µl).
13 µl davon sind der Mastermix, bestehend aus 10 µl Puffer, 1
µl Primer und 2 µl Transkriptase.
Enthält der Puffer schon dNTP´s? Ohne die geht es nämlich nicht.
Bei der Transkriptase hoffe ich mal, dass die extrem verdünnt ist. Sonst schmeißt du das Geld aus dem Fenster.
Die anderen 7 µl sind meine
Template-RNA plus Wasser. Ich soll laut
Protokoll 500ng RNA einsetzen und da ich in jeder Probe eine
andere Konzentration habe,
muss ich für jede Probe separat berechnen wie viel von den 7
µl Wasser und wie viel Template sind.
S.o. Wäre sinnvoller, es andersrum zu machen.
Wenn ein Verflüchtigen der Materialien eher unwahrscheinlich
ist, dann wird sich wohl im Nachhinein auch nicht mehr
feststellen lassen, worans gelegen hat. Ich hab bei so kleinen
Volumina auch immer ein Auge drauf, ob beim pipettieren
tatsächlich was in die Spitzen gesaugt wird und man hat ja
auch grob ein Gefühl für das Volumen.
Bei 13µl MM pro Probe kannst du es ja auch gut an Hand des Eppis, in das der MM pipettiert wird überprüfen. Du hättest 169µl drin haben müssen, bei dir waren es ja aber nur knappe 40µl. Der Unterschied ist leicht zu sehen.
Alles ziemlich merkwürdig. Da bleibt mir wohl nichts übrig,
als es einfach nochmal zu versuchen.
Ja. Wenn Fehler passieren, nicht danach suchen, was in dem Fall schief gelaufen ist. Das ist mühsam und bei sowas meist nicht möglich. Am besten alle möglichen Fehlerquellen überlegen, neu anfangen und jeden Schritt, an dem ein Fehler auftreten kann, kontrollieren.
Bin jetzt gerade bei meiner Masterarbeit und sowas ist mir in
10 Semestern Studium noch nie passiert…
Einmal ist immer das erste mal! Viel Erfolg noch bei deiner Masterarbeit.
Gruß
nok
Servus,
wenn mir so was passiert ist, dann hatte ich aus irgendeinem Grund (z.B. kurze Ablenkung durch ein Telefon) beim Anmixen des MM eine Komponente vergessen.
Verdunsten, auch bei 32° halte ich für unwahrscheinlich. So langsam wirst Du nicht pipettieren und außerdem sagtest Du die Proben waren auf Eis.
Pipetten sind ja geeicht, sagtest Du?
Gruß,
Sax
Servus,
noch ein Nachtrag: Du nimmst aber keine Multistepper-Pipette, oder?
Dort sind Verluste bzw. Ungenauigkeiten im Volumen nämlich eher möglich.
Gruß,
Sax
Pipette verwechselt?
Hallo,
wie schon von den anderen erwähnt, ist es wohl schwierig, den Fehler im Nachhinein auszumachen. Eine Idee hätte ich aber noch:
Wenn ich so einen MM pipettiere, würde ich für die 13 µl eine 20er Pipette nehmen, für die 130 µl Puffer eine 200er. Bei uns sehen die beiden Pipetten sich ziemlich ähnlich und wenn man keine Filter verwendet, passen auch die gleichen Spitzen auf beide Pipetten. Wenn man in Eile ist und die Skalierung nicht beachtet, kann sich so ein Fehler schon einschleichen,denke ich.
Viele Grüße
Paramecium
Hallo,
vielen Dank für all eure Ansätze Licht ins Dunkel zu bringen!
Die Pipetten, die ich verwendet habe sind alle geeicht und funktionieren einwandfrei.
Dass ich mich bei der Pipette vergriffen habe halte ich nicht einmal für sehr unwahrscheinlich, das ist schnell passiert. Aber man hat ja schon ein Gefühl dafür, ob man jetzt 13 oder 130µl in der Pipettenspitze hat. Und da in dem Eppi mit dem Puffer insgesamt nur 160µl drin waren, hätte ja so gut wie nichts fehlen dürfen, wenn ich fälschlicherweise nur 13µl entnommen hätte.
Es war tatsächlich so, dass in dem Mastermix-Eppi einfach zu wenig drin war.
Ich habe mal mit einer Doktorandin hier im Labor über das Problem gesprochen und sie meinte, dass es auch schon vorgekommen ist, dass ein Eppi durch einen Fertigungsfehler nicht dicht ist. Danach hab ich natürlich nicht geschaut, werde ich künftig aber auf jeden Fall tun.
Ich habe inzwischen den Mastermix neu pippetiert und es hat ohne Probleme geklappt. Also woran auch immer es gelegen hat, der Fehler ist nicht wieder vorgekommen.
Weil irgendjemand gefragt hatte: ja, die dNTPs sind im Puffer schon mit drin.
Wir beziehen alle Komponenten für den Mastermix in einem KIT und wie weit die Transkriptase verdünnt ist weiß ich nicht genau. 20µl Ansätze sind bei uns eigentlich Standard und sicher, man könnte auch mit weniger arbeiten aber bei einem 2µl Ansatz hätte ich ja Volumina von 0,1µl zu pipettieren, klar geht auch, aber für die anschließende PCR brauche ich ja auch eine gewisse Menge.
Also nochmal vielen Dank an alle und liebe Grüße