Hallo Bioexperten,
könnt ihr mir bitte sagen wie man Viroide identifiziert?
Soweit ich in den Journals herauslesen konnte, muss man diese Prozesskette machen:
a) RNA isolieren
b) reverse transcribieren
c) PCR
d) Southern blot (elektrophorese)
Stimmt das soweit oder fehlt da noch etwas?
Kann man es nicht auch mit Northern blot identifizieren?
Welche Bioassay Möglichkeiten gibt es dafür?
Lg,
Chris
Da ich noch nie mit Viroiden gearbeitet habe und schön länger nicht mehr molekularbiologische arbeite: betrachte diese Infos unter Vorbehalt.
Ich würde so vorgehen:
(1) RNA isolieren [=Dein Schritt a]
(2) Real time RT-PCR [=b+c+d]
(3) Einmalig Amplicon sequenzieren lassen, um sicherzugehen, dass Du die richtige Sequenz identifziert hast [=d]
Southern Blot ist m.E. nicht (mehr) notwendig bzw. veraltete Methode; die Kombination (2) plus (3) ist eleganter.
Northern Blot ist ebenso eine elegante, aber veraltete Methode, zudem ziemlich frickelig wegen die bösen RNasen.
Falls kein Real-Time PCR-Gerät verfügbar ist, dann doch den Southern Blot wählen oder die Methode outsourcen. Dafür gibt es jede Menge Dienstleister…
Gruß,
Ivo
Hallo Ivo,
danke für deine Aw.
Die Real time RT-PCR wird dann nur mit der RNA, für die RNA gemacht?
Was macht man bei der einmaligen Amplicon sequenziern?
Ist dies eine quantitative Methode zur Identifizieren?
Oder wird diese verwendet vor/während der PCR um nur die RNA des Viroids zu vervielfachen?
Liebe Grüße,
Chris
Meine Antworten unten.
Ivo
Hallo Ivo,
danke für deine Aw.
Die Real time RT-PCR wird dann nur mit der RNA, für die RNA
gemacht?
->Im RT (=Reverse Transkriptase)-Schritt wird die RNA in cDNA transkribiert. Im Anschluss, im gleichen Reaktionsröhrchen, findet dann die PCR statt; es ist also eine Reverse-Transkriptase-Real-Time-PCR.
Was macht man bei der einmaligen Amplicon sequenziern?
-> Du reinigst das Reaktionsgemisch der PCR auf, so dass darin nur das Amplicon enthalten ist. Für diese Reinigung gibt es auch kommerzielle Kits. Das isolierte Amplicon wird zusammen mit den Primern der PCR an einen Dienstleister gesendet, der das Amplicon sequenziert.
Die Sequenzierung ist nicht zwingend, nur ein Vorschlag.
Du kannst das Amplicon auch per Gelelektrophorese sichtbar machen und anhand der Amplicon-Größe beweisen, dass Du die *richtige* Sequenz per PCR amplifiziert hast.
Ist dies eine quantitative Methode zur Identifizieren?
->Sequenzierung nein.
Real-Time PCR: ja.
Oder wird diese verwendet vor/während der PCR um nur die RNA
des Viroids zu vervielfachen?
->Ja, die PCR wird verwendt, um die RNA bzw. seine cDNA zu vervielfachen, damit Du genug Material für weitere Analysen hast, z.B. Sequenzierung oder Gelelektrophorese.
Liebe Grüße,
Chris
Gruß,
Ivo