Hallo!
Warum nehme ich dann zu erst einen polyklonalen Antikörper, wo
ich doch da das Protein spezifisch nachweisen möchte?
Ein Protein hat mehrere Epitope, an die Antikörper binden können.
Das Wort „polyklonaler Antikörper“ im Singular ist eigentlich falsch, weil es sich um ein Gemisch von verschiedenen Antikörpern handelt, die zwar alle spezifisch für das selbe Antigen sind, aber an verschiedene Epitope binden. Durch die Verwendung eines polyklonalen Antikörpers ist einfach die Wahrscheinlichkeit größer, dass nach der ganzen Probenaufbereitungsprozedur irgend ein Epitop noch erkannt wird.
Manchmal nimmt man auch bewusst einen unspezifischen Antikörper, wenn man nicht ein bestimmtes Protein sucht, sondern nach Angehörigen einer ganzen Proteinfamilie fahndet.
Angenehmer Nebeneffekt: Es ist einfacher, polyklonale Antikörper herzustellen als monoklonale.
Wäre ein
monoklonaler Atikörper nicht besser zum spezifischen Nachweis?
Kommt drauf an, was Du machen willst. Wenn Du nur nachweisen willst, dass ein bestimmtes Polypeptid vorhanden ist, eignet sich der polyklonale Antikörper besser. Möchtest Du wissen, ob eine ganz bestimmte Domäne des Proteins frei liegt oder maskiert ist, dann brauchst Du eben den monoklonalen Antikörper gegen dieses Epitop. Außerdem kann es sein, dass die Spezifität der Antikörper im pAK-Gemisch unterschiedlich ist. Da ist man mit dem mAK eher auf der sicheren Seite.
Hat das etwas mit der Denaturierung des Protein während der
SDS-PAGE zu tun?
Nicht direkt. Man kann einen nach SDS-PAGE und Westernblot auch mit einem mAK beproben.
Warum nehme ich danach einen monoklonalen Antikörper? Damit
weiße ich doch theoretisch nur den Erstantikörper nach.
Ich nehme an, dass Du damit den sekundären Antikörper meinst. Dabei handelt es sich ohnehin um ein standardisiertes Industrieprodukt, also zwangsläufig um einen mAK. Wenn Du z. B. einen „Anti-Mouse-IgG in Rabbit“ verwendest, der an irgend einen Fluoreszenz-Farbstoff gekoppelt ist, dann sollte der nicht einfach spezifisch gegen IgG gerichtet sein, sondern möglichst spezifisch gegen Mäuse -IgG. Außerdem sollte die sich die Affinitiät des Antikörpers zum Mäuse-IgG auch quanitativ halbwegs auswerten lassen, deswegen mAK.
Ich hoffe, das beantwortet Deine Fragen.
Michael
