Habe mir bei WIKI den Artikel zu RNA-iSOLATION durchgelesen. Anscheinend wird da nur der gesamte RNA gehalt einer Zelle extrahiert. Ich frage mich wie ich mit der Methode eine bestimmte RNA herausbekomme und deren Menge?
Tut mir leid, da kenne ich mich nicht aus.
Ja, bei der Methode wird die gesamte RNA isoliert.
Bestimmte RNA quantifizieren kann man wahrscheinlich mit Northern Blots, RNAseq (das bestimmt dann die Mengen aller RNAs) oder RNA microarrays (da markiert man gereinigte RNA mit Fluoreszenzfarbstoffen, tut sie auf einen Chip mit verschiedenen DNAs oder Oligonukleotiden, Oligonukleotide und RNA hybridisieren und man kann die Bindung mittels der Fluoreszenz auslesen).
Hoffe das hilft… sonst am besten noch mal antworten und nachfragen.
Hallo Joyner,
Der Trick, wie man eine bestimmte RNA vervielfältigt ist ein kleines Stück bekannter Sequenz Namens Primer.
Ich hole mal kurz aus:
- die RNA wird in der Regel für die weitere Verwendung in sogenannte copyDNA (cDNA) umgeschrieben. Das macht ein Enzym aus einem Virus, das hierfür missbraucht wird, die Reverse Transkriptase.
+mit Hilfe eines zweiten Enzyms zur DNA- Vervielfältigung, der Taq-Polymerase (von termophilus aquaticus, einem Archaebakterium) kann man nun die DNA im Reagenzgefäß vervielfältigen: hierbei gibt man zu den vielen RNA- Transkripten ein DNA-Fragment bekannter Zusammensetzung (der Primer, von priming- beginnen), das auf der gewünschten DNA binden kann, dazu.
Unter bestimmten Temperaturbedingungen bindet dieser Primer dann spezifisch nur auf dem Stück einzelsträngiger DNA, das das entsprechende „Gegenstück“ zu der Basenabfolge im Primer darstellt, unser Zielgen.
Da die Taq- Polymerase nur mit doppelsträngiger DNA arbeiten kann, werden dadurch spezifisch nur die Fragmente vervielfältigt, die einen Primer drankleben haben.
Danach schmilzt man die DNA auf, kühlt sie wieder ab, wieder binden Primer an die DNA und eine weitere Duplikationsrunde geht los usw…
nach bereits 6 dieser logarhythmischen Vervielfältigungsreaktionen gibt es von unserem Zielfragment bereits 1-2-4-8-16 32-64 mal mehr im Gefäß als von der ganzen anderen DNA- bei 20-30 Zyklen dieser Polymerase- KettenReaktion (PCR) sind das also Millionen mehr, sodass alle weiteren Reaktionen nur mit der Information von der Ziel-RNA arbeiten.
Ich hoffe das war verständlich- wenn nicht frag bitte nochmal nach…
Lieben Gruß,
Mathias
ok. wie kann ich eine ganz bestimmte RNA quantifizieren ohne eine PCR?
Das funktioniert, indem Du den Primer für die cDNA mit einem fluoreszierenden Molekül (oder einem radioaktiven Isotop) verbindest und dann die Lichtemission / Radioaktivität nach entsprechenden Waschschritten (um alles ungebundene zu entfernen) zu messen.
kann ich dir spontan auch nicht sagen, sorry!
Tut mir leid, davon habe ich keine Ahnung.
Armin pieroth