Wenn ich etwas klonieren will, muss ich ja erstmal eine PCR machen um das Gen, das ich untersuchen will zu vermehren. Woher bekomme ich dann den Primer, den ich dazu brauche? (forward und reverse) Stellt man sich sowas selber her (wenn ja wie?) oder bestellt man das oder macht sowas der Laborleiter?
Und noch ne Frage: Muss ich vor einer Klonierung/Transformation eigentlich immer wissen, welchen DNA-Abschnitt ich einbauen will?
Hallo joyner,
Zu den Primern:
Die werden per Syntheseverfahren hergestellt. Die Synthesen übernehmen spezialisierte Firmen. Ein „Oligo“ (für Oligonukleotid, also ein Primer) kostet ca. 30 Cent je Base. Heißt, ein Primer kostet für gewöhnlich nur ca. 6 Euro. Für dieses Betrag bekommt man dann genügend Material, um Dutzende und ggf. sogar Hunderte von PCRs zu fahren. Eine dieser Firmen ist zum Beispiel MWG Eurofins. Es gibt aber auch viele andere. Design > Synthese > Lieferung erfolgen innerhalb 48 Stunden.
Bei einer Klonierung (ergo auch bei einer Transformation) muss man nicht zwingend genau wissen, welches DNA-Fragmente man in Bakterien einbringt. Im Gegenteil: manche Verfahren sind sogar darauf ausgelegt, dass man es nicht weiß.
Beispiel: In den frühen Tagen der Sequenzierung von Genomen wurde genomische DNA in kleine Fragmente zerhackt. (Zum Beispiel durch Restriktionsverdau.) Dann wurden die DNA-Fragmente in Plasmide eingebracht. Mit diesen Plasmiden wurden Bakterien transformiert. Anschließend wurde aus (vielen) einzelnen Klonen DNA präparativ gewonnen - und damit also vervielfältigt. Diese DNA war dann ausreichend aufkonzentriert um sie zu sequenzieren. So konnte man Stück für Stück (sprich Klon für Klon) eine genomische DNA durchsequenzieren. Die DNA-Bibliothek konnte im Gegenzug auch genutzt werden, um ein Gen zu klonieren: wusste man eine kurze Nukleotidsequenz eines zu untersuchenden Gens, konnte man mit DNA-Sonden den Bakterienklon ausfindig machen, der das relevant Stück genomischer DNA enthielt. Dann konnte man so das Gen in die Hände bekommen.
Heute alles nicht mehr nötig. Fast die komplette genomische Sequenz ist bekannt. So kann man Primer so designen, dass man forward und reverse Primer quasi links und rechts von der relevanten Sequenz ansetzt und so kann man die benötigen DNA-Fragmente direkt aus genomischer oder (beim Klonieren eigentlich öfter) cDNA gewinnen.
Außerdem kann man heute schon komplette „Gene“ in vitro synthetisieren. Kostet ca. 50 Cent je Basenpaar. Also gerade einmal um die 400 Euro, möchte man zum Beispiel eine GFP codierende DNA synthetisieren lassen.
Ist dann doch eine ausführlichere Antwort geworden.
Grüße!
Theo Doric
Hi,
Die Primer bestellt man, es gibt Firmen, die darauf spezialisiert sind, kurze Oligonukleotide herzustellen, z.B. metabion.
Du musst vorher genau wissen, was du einbauen willst, wie die Sequenz ist und auch, ob du die Promotorregion benötigst bzw. welche Teile davon (das ist vom Vektor abhängig).
Grüße
Die Primer musste du selber herstellen ausser es handelt sich vielleicht um ein house-keeping gene, da sind eventuell welche kommerziell erhaeltlich. Du kannst auch Veroeffentlichungen lesen und schauen welche Primer schonmal benutzt wurden und ein positives PCR product produzierten. Die DNA sequence deiner Primer schickst du an eine Firma die Oligo’s herstellt, ist nicht teuer. Und ja, du solltest wissen welche DNA Abschnitte du einbauen willst, PCR producte sind spezifisch fuer die festgelegte DNA zwischen den Primers.
Kannst mal auf der Seite schauen:
http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_…
Es gibt auch Software die du benutzen kannst um die otimalen Primer zu erzielen.
Grundsätzlich solltest Du natürlich schon wissen, was Du tust, die genaue Sequenz brauchst Du bei blunt end Ligationen nicht. Bei sticky end Ligationen hast Du ohnedies eine Sequenz/Schnittstelle von Deinem Restriktionsenzym. Primersequenz brauchst Du schon.
Ad Primer: werden kommerziell gemacht, dh ja, zukaufen, nicht selber machen. Geegle mal nach „Oligosynthese“, da findest Du viele Anbieter, musst nur Deine Sequenz und die gewünschten Modifikationen angeben.
Hallo!
Ich habe die Primer immer bei Invitrogen bestellt. Recht günstig und schnell. Zuvor brauchst du aber die Sequenz der Primer. Entweder findest du die Sequenz dann in entsprechenden Artikeln oder man muss sich die Primer selbst designen, z.B. mit dem Clone Manager (SE Central). Meist haben die Laborleiter dann aber schon eine bevorzugte Bezugsquelle.
Viel Erfolg, Nadine
Hallo Joyner
Primer lässt man sich synthetisieren.
Entweder es gibt an der Uni eine Swrviceabteilung, die das macht - oder man bestellt die bei einer Firma, die das macht. Frag doch Deine Kollegen oder ältere Semester.
Gruss
yps
Hallo,
üblichrweise designed man die Primer selbst und lässt sie dann von einer Firma z.B. Sigma-Aldrich synthetisieren. Das kostet nur kleines Geld.
Es macht schon Sinn vor der Klonierung zu wissen, was man einbaut.
Viele Grüße
Marcus
PS: Sorry, dass ich mich jetzt erst melde, ich war im Urlaub.
Hallo joyner,
ich bin mir nicht ganz sicher wie Deine Frage gemeint ist, da ich nicht weiß, um was für ein Gen es sich handelt.
Für viele Gene gibt es bereits etablierte Primersequenzen, die gut funktionieren. Falls es sich um ein solches handelt kannst Du einfach die Sequenz nutzen um Primer zu bestellen. Falls es keine Primer gibt, kannst Du, wenn Du weißt um welches Gen es sich handelt konservative Randbereiche nutzen um eigene Primer zu designen. ein Datenbankabgleich ist hier hilfreich, es kann aber dabei immer zu ungewünschten Bindungsstellen kommen, daher braucht dieser Ansatz oft mehrere Anläufe bis man spezifische Primer hat. Außerdem sollte man das Produkt verifizieren um sicher zu stellen, dass du tatsächlich das Gen kopierst, dass Du suchts. Hierzu kannst Du Sequenzbereiche von möglichst mehreren verwandten Organismen (verwandt zu Dienem Zielorganismus, von dem Du das Gen untersuchen möchtest) analysieren und Bereiche suchen, die keine Mutationen aufweisen. In diese legst DU dann die Primer. Es gibt Programme, die Eigenschaften der Primer auswerten können um möglichst gut bindende und spezifische Primer zu finden. Wills Du nicht nur einen Organismus untersuchen mußt Du DNA von möglichst verschiedenen Organismen untersuchen um einen identischen Bereich zu finden. Hier ist jedoch auch meist das Risiko größer, dass es mehrere Bindungsstellen gibt, aber das kann man dann halt nur durch PCR rausfinden.
Ob Du oder Dein Laborleiter für diese Arbeit zuständig sind kann ich nicht sagen, aber wenn Du noch keine Erfahrungen mit Sequenzanalyse hast, solltest Du zumindest Unterstützung für den ersten Versuch erhalten…
Nein, mußt Du nicht.
LG, Miah.